摘要
异位子宫内膜间质细胞（EESCs）处于铁超载的微环境中，对氧化损伤更敏感。Erastin诱导的铁死亡的特征是致死性脂质活性氧(ROS)的铁依赖性积累。用Erastin处理培养的胚胎干细胞总活性氧水平、脂质活性氧水平和细胞内铁水平显著增加，还观察到较短且浓缩的线粒体，其产生的细胞*性可被铁死亡抑制剂减弱。这些发现一起表明Erastin能够诱导通过铁死亡诱导EESC死亡，但其对正常子宫内膜间质细胞（NESCs）的影响很小。Erastin诱导的胚胎干细胞铁死亡过程伴随着铁的积累和铁转运蛋白(FPN)表达的降低。FPN可以消除Erastin诱导的胚胎干细胞的过度表达，此外FPN基因的敲除加速了铁死亡。在一个子宫内膜异位症的小鼠模型中，发现在Erastin给药后异位病变消退。说明Erastin可以诱导子宫内膜异位症患者的铁死亡，使子宫内膜异位病变消退，此发现揭示了Erastin作为子宫内膜异位症的潜在治疗方法。
背景：子宫内膜异位症中铁稳态的失衡可以促进异位病变的植入和发展。一些研究采用子宫内膜间质细胞作为工作模型，发现铁超载可激活NF-kB信号通路并导致二价金属转运蛋白-1(DMT1)过度表达以促进氧化应激介导的促炎信号通路。
铁代谢可能在这一过程中发挥关键作用。Erastin可以通过电压依赖性阴离子通道(VDACs)加速氧化和通过减少胱氨酸转运降低抗氧化防御来促进ROS的积累，铁的缺乏导致抗铁死亡。
铁转运蛋白(FPN)是一种负责输出细胞铁以维持铁稳态的跨膜蛋白。铁转运蛋白缺乏可导致一系列铁超载疾病。在用柠檬酸铁铵处理后，FPN单独的过度表达可以增加铁的流出，以防止细胞内铁的升高。敲除基因可加速Erastin诱导的神经母细胞瘤细胞凋亡。
结果
Erastin在胚胎干细胞中引发铁死亡
为确定Erastin对子宫内膜异位症的作用，从子宫内膜异位囊肿和正常子宫内膜中分离出原代基质细胞，然后用不同浓度的Erastin在培养基中处理0-10μΜ的细胞24小时。10μΜ的Erastin在EESCs中诱导细胞脱离和明显死亡（图1A），但Erastin不影响NESCs的生存能力，定量结果也一致(图1B)。接下来研究过程中的过氧化变化。首先用荧光探针H2DCFDA研究总活性氧水平，用Erastin处理EESCs培养9小时显著增加了总活性氧水平（图1D），而Erastin处理没有改变胚胎干细胞中的总活性氧水平。为准确了解活性氧增加的来源，脂质活性氧在与10μΜErastin在胚胎干细胞或胚胎干细胞中共培养后，用C11-BODIPY荧光染料评估的结果显示，用Erastin处理EESCs培养10小时显著提高了脂质ROS水平(图1E)。丙二醛（MDA）能在一定程度上反映脂质活性氧的水平，MDA测定的结果显示出相似的趋势(图1C)。
为进一步揭示Erastin诱导细胞死亡的方式，用细胞死亡抑制剂和Erastin处理NESCs或EESCs。铁死亡抑制剂ferrostatin-1和liproxstatin-1以及铁螯合剂去铁胺(DFO)消除了Erastin诱导的EESCs死亡(图1F)，而凋亡抑制剂ZVAD-FMK和坏死抑制剂necrostatin-1未能维持胚胎干细胞的生存能力(图1F)。为评估形态学特征观察超微结构的变化，在EESCs用Erastin孵育后，线粒体变短，膜密度增加(图1G)。
综上，结果支持了EESCs比NESCs对Erastin更敏感，并且Erastin诱导的EESCs的细胞死亡显示出铁死亡的特征。
图1
Erastin诱导的EESCs铁死亡过程伴随着铁的积累和FPN表达的降低
为进一步了解铁的机制，对EESCs和NESCs用Erastin处理进行关于游离亚铁的时间梯度实验。观察到在EESCs中，亚铁在6小时开始升高。延长Erastin的孵育时间进一步促进了胚胎干细胞中铁的积累，但Erastin处理未改变NESCs中的亚铁水平(图2A)。为了探索细胞内铁积累的途径，分析了铁相关蛋白的基因表达水平，如转铁蛋白(TFR，铁输入者)，DMT1(铁输入者)，FPN(铁输出者)和铁蛋白(储存者)。结果表明Erastin治疗显著降低了EESCs和NESCs的FPN表达(图2B)。
图2
异位子宫内膜中铁积聚和FPN蛋白水平降低
FPN主要位于细胞膜上，异位子宫内膜间质细胞的FPN蛋白水平低于正常子宫内膜间质细胞，但其铁含量显著积累，同时正常和在位子宫内膜几乎没有铁积累(图3A)。与卵巢子宫内膜异位症的子宫内膜相比，异位子宫内膜的FPN水平仍较低(图3A)。还发现与来自正常子宫内膜的基质细胞相比，来自异位子宫内膜的显示出减少的趋势(图3B)。Westernblotting还记录了在Erastin刺激后FPN蛋白水平的降低(图3C)。这些数据间接支持了FPN在细胞铁积累过程中起重要作用。
图3
腺病*介导的FPN基因过量表达可消除Erastin诱导的EESCs铁死亡效应
为进一步揭示FPN在Erastin诱导的铁死亡功能中的作用，作者将表达FPN基因的腺病*感染EESCs24小时，再用Erastin感染。结果显示，感染24小时后FPN基因和蛋白质水平显著升高(图4A和乙)。FPN过度表达消除了对Erastin的敏感性(图4C)。FPN的过表达通过降低总活性氧和脂质活性氧的水平逆转了Erastin诱导的铁死亡（图4D和E）。这些结果表明，FPN在EESCs的Erastin诱导的铁死亡中发挥了重要作用。
图4
FPN缺乏加速Erastin诱导的胚胎干细胞的铁沉积
如上所述，FPN的过度表达抑制了Erastin诱导的EESCs的铁死亡效应。为进一步探索FPN在铁死亡中的作用，用阴性对照siRNA或FPN·siRNA转染胚胎干细胞，然后用Erastin处理。siRNA转染后48和72小时，FPN基因和蛋白质水平显著降低(图5A和B)。与阴性对照组相比，敲除FPN增加了对Erastin的敏感性(图5C)。FPN·siRNA的强制表达，而不是阴性对照siRNA，加速了Erastin诱导的总活性氧和脂质活性氧的上调(图5D和E)。这些数据进一步证实了FPN对Erastin诱导EESCs铁死亡的生物学功能至关重要。
图5
Erastin可使小鼠子宫内膜异位症模型中的子宫内膜异位植入物退化
为了进一步探讨Erastin在体内的有效性，我们建立了小鼠子宫内膜异位症模型。子宫内膜异位样病变后两周用Erastin或豆油给药(图6A)。观察到用40mg/kgErastin治疗2周后，异位病变的大小减小(图6C)。同时，HE染色显示上皮细胞和基质细胞成功形成囊性子宫内膜异位病变(图6B)。Erastin对小鼠的体重影响很小或没有影响，小鼠的毛发显示出整齐和有光泽。
图6
讨论
铁积累水平是诱发铁死亡的驱动因素，在子宫内膜异位症患者中存在细胞铁超载的情况，因此激活铁死亡可能是治疗子宫内膜异位症的一种新的治疗策略。作者目前的研究证明Erastin可以通过触发铁死亡来逆转异位病变，还发现FPN通过调节EESCs的细胞内铁水平参与了Erastin诱导的铁死亡。
为研究Erastin对子宫内膜异位症的作用，首先发现，与NESCs相比EESCs更容易受到Erastin诱导的铁死亡的影响。鉴于脂质过氧化信号被越来越多地认为是铁死亡的核心介质，检测相关标记物，发现EESCs经Erastin处理后氧化产物水平升高，还观察到较短且浓缩的线粒体。此外，某些铁死亡抑制剂可减弱Erastin的细胞*性，但不能减弱凋亡抑制因子ZVAD-FMK和坏死抑制因子的细胞*性。这些发现共同表明，Erastin能够通过激活铁死亡诱导EESCs死亡(图1)。为探索Erastin是否能在体内发挥类似的生物学作用，建立了小鼠子宫内膜异位症模型，并对实验组的异位病变进行了研究(图6)。
在显示铁含量丰富的异位子宫内膜中，FPN表达较低(图3)。在用Erastin处理的培养的EESCs中，观察到FPN的表达进一步下调，铁持续积累(图2)。这促使作者研究FPN和铁在Erastin诱发的铁死亡中的作用。已经证明，FPN是唯一公认的哺乳动物铁出口国，被认为是铁稳态的关键。在与FPN突变相关的病变细胞中存在铁超载的情况，此外，在TFR、DMT1、铁蛋白轻链(FTL)和铁蛋白重链(FTH)的mRNA表达水平上没有显著差异(图2)。因此，作者推断Erastin·主要通过下调FPN表达来丰富细胞铁池。为进一步揭示FPN在Erastin诱导的铁死亡过程中的作用，我们过度表达了FPN，并发现Erastin诱导的铁死亡的效应被消除了(图4)。此外，FPN缺乏加速了EESCs的细胞死亡(图5)。因此，FPN解除管制引起的细胞内铁水平升高在此过程中起了重要作用。最近，有研究揭示了Erastin可通过调节人乳腺癌细胞(MDA-MB-)中铁蛋白/FPN代谢，通过增加铁水平来触发铁死亡。铁蛋白/FPN的这些协同变化很大程度上依赖于共济失调-毛细血管扩张症(ATM)和金属调节转录因子1(MTF1)活性的突变。在接下来的研究中，作者将探讨Erastin诱导的胚胎干细胞FPN去调控的生物学机制。作者推测EESCs不能消除更多由Erastin诱导的铁积累产生的活性氧，这个问题需要进一步调查。
总之，此研究证明了Erastin能够通过铁缺乏诱导胚胎干细胞死亡。在体内，Erastin的给药减少了子宫内膜异位症小鼠模型中子宫内膜异位样病变的体积。这些发现表明Erastin可能是一种有前途的子宫内膜异位症新的治疗方法。调节细胞内铁浓度的FPN是Erastin诱导的铁死亡的一个负面因素。为了解FPN的作用，还需要做更多的工作，以便确定子宫内膜异位症未来治疗的最佳靶点。
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